3.1.Mumps Virus Antijenlerinin Elde Edilmesi
3.1.1. Virus

            Çalışmamızda kullandığımız Mumps virusunun Enders Suşu, National Institue of Public Healt Virology Department (Oslo/Norwey) orijinli olup, Gülhane Askeri Tıp Akademisi Haydarpaşa Eğitim Hastanesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji servisinden sağlandı.

3.1.2. Hücre Kültürünün Hazırlanması
            Mumps virusunun üretiminde Afrika yeşil maymun böbrek hücre kültürü olan vero hücreleri kullanıldı(33,38,39,43,88,91,92,95,96,105).

            Hücre kültürü üretilmesinde,Minimal Essential Medium (MEM)            (Seromed, Biochrom KG, Cat no: T 051-10, Lot no: 7W 09) besi yerinden yararlanıldı.

            MEM................9.7 gr.
            Bidistile su....1000 ml

            Toz madde suda eritildi.Filtrasyonla sterilize edildi. +40 C de saklandı. (85,86,105). 
Her 100 ml. Besiyerine,

            Dana serumu (560 de 30 dakika inaktive edilmiş)...10 ml
            NaHCO3 (%4.4)..................................................    .......2 ml
İlave edildi(11,55,85,86,95)

            Bakteri ve mantar kontaminasyonunu önlemek amacıyla besiyerine streptomisin (100?g/ml), penicillin G (100 U/ml),gentamisin (25??g/ml) ve flukonazol (25 U/ml) ilave edildi. Besiyerinin pH’ı % 4.4 lük NaHCO3 ile 7.2-7.4’e ayarlandı. Besi yerine esansiyel olmayan aminoasitler (Sigma MEM 50x, Cat no: M7020, Lot no: 120H-4614) ve vitamin solusyonu (Sigma MEM 100x, Cat no:M6895, Lot no: 90H-4629) ilave edildi (95,102).

            Çalışmaların her aşaması, steril ünit içinde yapıldı. Çalıştığımız alanın sterilizasyonunda, ultraviole lambaları kullanıldı. Kullandığımğz bütün solusyonların, 370 C’ lik etüvde bekletilerek steril olduğunu önceden saptadığımız kanlı agar plaklarına ekilerek kontaminasyon kontrolleri yapıldı.

            Hücre kültürünün pasajı amacıyla PBS içerisinde % 0.25 lik tripsin solusyonu kullanıldı.

            Tripsin (Sigma T 0646 )
                       Tripsin                                              2500 mg
                        NaCl                                                 8000 mg
                        KCl                                                   200 mg
                        Na2 HPO4                                      1150 mg
                        KH2PO4                                         200 mg
                        Distile su                                         1000 ml

            Bütün maddeler distile suda eritildi. PH 7.6 ya ayarlandı. Filtre edilerek sterilizasyonu sağlandı. 50’şer mililitre vidalı kapaklı şişelere konularak -400  C’de dipfrizde saklandı. Kullanışacağı zaman 370 C’lik benmaride ısıtılıp ılık olarak hücre kültürlerinin pasajı amacıyla kullanıldı. (85).

            Besiyeri döküldükten sonra monolayer hücre kültürlerinin üzerine % 0,25 lik tripsin ilave edildi. (11). Hücre üzerinde tripsin kısa bir süre tutulduktan sonra şişe ters çevrilerek 370 C’lik etüve kaldırıldı. Bir süre etüvde bekletilerek hücrelerin tripsinin etkisiyle şişe yüzeyinden ve birbirlerinde ayrılması sağlandı. Tripsin atıldıktan sonra şişeye 12 ml. %10 fötal dana serumlu hücre kültürü besi yerinden ilave edilerek iyice pipetlendi ve hicrelerin birbirlerinden ayrılması sağlandı. Hücre süspansüyonu eşit büyüklükte 3 şişeye 4’er ml konuldu. Hücre hacminin % 10’u olacak şekilde fötal dana serumlu MEM ilave edilerek 370 C’de inkübasyona bırakıldı. Her gün doku kültürü mikroskobunda hücre kültürleri incelendi. 2 veya 3 gün sonra tek katlı hücre tabakası oluşan şişe yüzeyini tam dolduran, normal görünümde olan hücre kültürleri virus üretiminde kullanıldı (59,85). Saklamak istediğimiz hücre kültüründeki besi yerleri dökülerek, üzerlerine %1 fötal dana serumu içeren idame besi yeri ilave edildi ve beklemeye alındı. Bu şekilde beklemeye alınan hücrelerin besi yerleri 5 günde bir değiştirildi. 

3.1.3 Mumps Virusunun Vero Hücre Kültüründe Üretilmesi
            Doku kültür mikroskobunda kontrol edilen, normal olduğu saptanan ve %75-100 oranında şişe yüzeyini kaplayan hücrelerin virus üretimi için uygun olduğu kabul edildi. Bu özellikleri taşıyan hücre kültürlerinin besiyeri dökülerek ılık PBS ile yıkandı. Daha sonra Mumps virusunun stok solusyonundan 1 ml hücre üzerine ilave edildi. Hafifçe çalkalanarak sıvının tüm yüzeye yayılması sağlandı. Virusun hücrelere adsorbe olması amacıyla 370 C’de 1 saat bekletildi. (60,85) Süre sonunda her şişeye % 1 fötal dana serumu içerem MEM besiyeri ilave edilerek 370 C’lik etüvde virus üremeye bırakıldı. Virus ekili hücre kültürü hergün mikroskopta kontrol edildi ve %75-100 oranında sitopatik etki (CPE) görülen hücre kültürleri steril bir şişede toplandı ve –40 de dipfrizde saklandı. 

3.1.4.Antijen Elde Edilmesi
            Mumps virusu ile enfekte edilmiş vero hücre kültürleri, üç defa dondurulup çözülerek santrifüj tüplerine alındı. Hücre süspansiyonunun 5000 devirde 10 dk. Santrifüjlenmesiyle elde edilen süpernatant antijen olarak kullanıldı (61).

3.1.5. Antijen Hemaglutinasyon Titresinin Saptanması
            Phosphate Buffer Saline (PBS): Eritrosit yıkama ve dilüsyonlarının hazırlanmasında ve tüm testte sulandırıcı olarak PBS kullanıldı. 

                        KCl                                     200 mg
                        NaCl                                   8000 mg
                        Na2 HPO4                         910 mg
                        KH2PO4                            120 mg
                        Distile su                            1000 ml

            Maddeler karıştırılıp suda eritildi. PH 7.2 ye ayarlandı ve 1200 C’de 30 dakika sterilize edildi. +40 C’de saklandı.(85,86)

            Alsever Solusyonu:

                        Dextrose                                    20.5  gr
                        Sodyum citrate                          8.0   gr
                        Citric acide                                0.55 gr
                        Sodyum chloride                       4.2   gr
                        Distile su                                    1000  ml

            Bütün maddeler suda eritilip seitz filtresinden süzülerek sterilize edildi ve kobay eritrositlerinin stabil olarak saklanmasında kullanıldı. Alsecer solusyonu içine 1/3 oranında kan konuldu ve 40 C’de 1 gün bekletildikten sonra kullanıldı. (86)

            Kobay eritrositleri sağlıklı kobayların kalplerinden alındı ve 3 hafta süreyle Alsever solusyonunda saklanarak kullanıldı.

            Üretilen Mumps virusu antijenlerinin hemaglütinasyon titresinin belirlenmesi amacıyla U çukurlu mikrotitrasyon pleytinde (8x12 Greiner 6501) hemaglütinasyon testi yapıldı. Bu amaçla pleytlerin 2.3.4....8. çukurlarına 0.05 ml PBS konuldu. 1 ve 2. çukura 0.05 ml Mumps virus antijeninden ilave edildi. 2. çukurdan itibaren 8. çukur dahil dilüsyon işlemi yapıldı. Bu amaçla 50 mikrolitrelik otomatik pipet kullanıldı. Son çukurdan 0.05 ml sıvı dışarı atıldı. Bu şekilde viral antijenin 1/1,1/2,1/4,1/8,...1/128’lik dilusyonları hazırlandı.

            Alsever solüsyonunda saklanan taze kobay eritrositleri, 3 kez PBS ile yıkandıktan sonra % 50’lik suspansiyonu hazırlandı. Tüm çukurlara %0.5 lik kobay eritrosit süspansiyonundan 0.05 ml. konuldu. Eritrosit kontrolü olarak 3 kuyucuğa 0.05 ml PBS + 0.05 ml % 0.5 kobay eritrosit süspansiyonundan ilave edildi. Buharlaşmaya engel olmak amacıyla transparan bir kapakla kapatılan pleytler sarsıntısız ortamda ve oda ısısında 1 saat bekletildikten sonra değerlendirildi. 

            Test pleytlerinin değerlendirilmesinde önce eritrosit kontrol çukurlarına bakıldı. Kontrol çukurlarında eritrositlerin görilmemesi halinde pleytler değerlendirilmeye alındı. 

            Çukurlardaki eritrositlerin dantela tarzında görülmesi hemaglütinasyon pozitif, düğme tarzında görülmesi halinde hemaglütinasyon negatif olarak değerlendirildi. Hemaglütinasyon görülen en son çukurdaki virus sulandırımına göre antijenin hemaglütinasyon titresi belirlendi. (2,42,47,86)

3.2 Hemaglütinasyon Önlenim Testi ( HA-Ö) (61,87,94,95)
            Daha önce hemaglutinasyon testi ile titresi saptanan Mumps virus antijenleri tekrar test edilerek hemaglütinasyon titreleri belirlendi. Antijen 4 hemaglütinasyon ünitesi (HÜ) virus içerecek çekilde sulandırıldı ve HA-Ö testinde antijen olarak kullanıldı.

3.2.1 Test Serumları
            GATA Haydarpaşa Eğitim Hastanesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji servisi laboratuvarlarına çeşitli testler için gönderilen serumlardan ayrıldı ve kullanılıncaya kadar –400C de saklandı. 

3.2.2. Kontrol Serumlarının Elde Edilmesi
            Pozitif kontrol serum hemaglütinasyon titresi 1/64 olan Mumps virusundan, tavşanlara 4‘er gün aralıklarla 4 kez deri altı ve bir kez damar içi yolla, 1’er ml enjekte edildi. Bir hafta sonra steril koşullarda tavşanların kanı alındı ve serumları ayrıldı. Titreleri 1/320 ve 1/640 olarak saptandı ve pozitif kontrol serumu olarak kullanıdı. 

            Negatif kontrol serum bağışıklanmamış normal tavşanlardan elde edildi. 

3.2.3. Serumlardaki Nonspesifik İnhibitörler ve Heterofil Antikorların Adsorbe Edilmesi.
            Tüplere serum örneklerinde 0.1 ml konularak, ısıya duyarlı nonspesifik inhibitörlerin ortadan kaldırılması amacıyla 56oC de 30 dakika inaktive edildi(4,18,32,34,42,47,87). İnaktive serumların üzerine nonspesifik aglütininleri ortadan kaldırmak için % 50’lik 0.6 ml kobay eritrosit süspansiyonu ilave edildi. Tüpler iyice çalkalandıktan sonra oda sıcaklığında 30 dakika bekletildi. Daha sonra 3000 devirde 15 dakika santrifüj edildi. Serumda bulunabilen ısıya dayanıklı nonspesifik inhibitörlerin inaktive edilmesi için sodyum periyodattan yararlanıldı(32,34,42). Bu amaçla taze hazırlanan 0.1 M sodyum periyodat’dan 0.3 ml ilave edildi. Karışım 37oC’de 30 dakika bekletildi. Üzerine 0.3 ml %40 glukoz solusyonu ilave edildi. Böylece serum dilüsyonunun 1/10 olması sağlandı. 

3.2.4 Hemaglütinasyon Önlenim Testini Yapılışı
           - U çukurlu mikropleytlerin 3.4.5.6......12. çukurlarına 0.05 ml PBS ilave edilerek, her sıra bir serum örneği için ayrıldı. Her sıranın 1,2 ve 3. çukurlarına 1/10 serum dilüsyonundan 0.05 ml ilave edildi.

           - 3. çukurdan itibaren serumlar, 50?l’lik otomatik pipetle dilue edildi. 12. çukurdan 0.05 ml sıvı dışarı atıldı. Böylece serumların 1/10’dan 1/10240’a kadar dilusyonları yapılmış oldu.

           - Her sıranın ilk çukurları hasta serum kontrolleri için ayrıldı ve bunlara antijen ilave edilmedi.

           - 1. çukur hariç bütün çukurlara 0.05 ml HÜ antijen ilave edildi ve pleytler çalkalanıp 1 saat oda ısısında bekletildi. Bu süre içinde antijen-antikor reaksiyonunun gerçekleşmesi beklendi.
? Bütün çukurlara %0.5 kobay eritrosit süspansiyonundan 0.05 ml ilave edildi. Pleytler tekrar çalkalandı. 1 saat oda ısısında bekletildi ve süre sonunda sonuçlar değerlendirildi. 

            HA-Ö Testinde Yer Alan Kontroller:
           - 3 çukur virus kontrolü: 
           0.05 ml PBS+0.05 ml 4HÜ virus antijeni+0.05 ml %50’lik eritrosit süspansiyonu
        - 3 çukur eritrosit kontrolü:
            0.1ml PBS+0.05 ml %0.5 eritrosit süspansiyonu
        - Hasta serum kontrolü:
           Her sıranın ilk çukuru 0.05 ml serum+0.05 ml %0.5 eritrosit süspansiyonu
           - Pozitif ve negatif serum kontrolleri:
           0.05 ml serum(pozitif ve negatif)+ 4HÜ virus antijeni+0.05 ml %50’lik eritrosit süspansiyonu

         Sonuçların değerlendirilmesi:
           Pleytlerin değerlendirilmesinde önce kontrol çukurlarına bakıldı. Eritrosit, hasta serumu ve pozitif kontrol serumu içeren kontrol çukurlarında hemaglütinasyonun görülmemesi, buna karşın virus ve negatif serum içeren kontrol çukurlarında hemaglütinasyon görülmesi halinde, testin değerlendirilmesine geçildi. Pleytin her serum sırasında, hemaglütinasyonun önlendiği son çukurdaki serum dilusyonu, hemaglütinasyon önlenim antikorlarının titresi olarak belirlendi. 

3.3. ELISA Testinin Uygulanması

           Kaplama ve yıkama solusyonlarının hazırlanışı

           Kaplama Solüsyonu pH 9.6 Coating Buffer)

           NaCO3                        1.59 gr
           NaHCO3                      2.93 gr
           NaN3                            0.2   gr

           Maddeler 1 litre distile suda eritildi ve pH 9.6 ya ayarlandı. Oda ısısında 2 hafta saklandı (20,22,63,70,114)

           Yıkama Solusyonu:

           NaCl                                            8.0 gr
           KH2 PO4                                    0.2 gr
           NaH2PO4 .12 H2O                   2.9 gr
           KCL                                             0.2 gr
           NaN3                                           0.2 gr
           Tween 20                                    0.5 ml

           Maddeler 1 lt suda eritildi ve buzdolabında saklandı ( 20,63,70,114).

3.3.1. Mumps Antijeninin ELISA Testi Icin Optimal Dilusyonunun Saptanması:
            HA-Ö testi ile pozitif ve negatif olduğu saptanan serumlar, kontrol serumu olarak kullanıldı. Bu serum ların 1/100 – 1/800 arası iki katlı dilusyonları ile Mumps antijeninin ¼,1/8,1/16,1/32 dilusyonları test edildi ve böylece optimal dilusyonları belirlendi (14,19).

3.3.2. ELISA Striplerine Mumps Antijeninin Kaplanması
            Vero hücre kültüründe hazırlanan Mumps antijewni, kaplama solusyonu ile 1/16 oranında sulandırıldı. Yüksek düzeyde protein bağlama kapasiteli 96 çukurlu dü tabanlı polistiren mikro ELISA pleytleri (granier 756071) katı faz olarak kullanıldı( 9,14,22,39,41,43,76,96,105).

           Striplerin her kuyucuğuna, kaplama solusyonu ile dlue edilmiş antijenden 0.1 mlş ilave edildi. Buzdolabında, nemli ortanda bir gece bekletildi. Ertesi gün pleytlerdeki antijen aspire edildikten sonra % 0.05 Tween 20 içeren yıkama solusyonu ile 3 kez yıkandı (31,39,41,43,59,67,68,76,88,92,96). Daha sonra bloklama işlemi yapıldı. Bu amaçla 5 0.05 Tween 20 içeren 0.15 M PBS içerisinde hazırlanmış %1‘lik yağsız süt tozu kullanıldı. Pleytin bütün çukurlarına taze hazırlanmış blok solusyonundan 0.2’şer ml ilave edildi. 370C’ de 1 saat inkübe edildikten sonra, yıkama solüsyonu ile 3 kez yıkanıp kurutuldu. Naylon torbalara yerleştirilerek kullanılıncaya kadar buzdolabında saklandı (709

3.3.3. Kontrol Antijenlerinin ELISA Striplerine Kaplanması
            Virusla enfekte edilmemiş vero hücre kültürü, kontrol antijeni olarak kullanıldı. Bu amaçla vero hücre kültürü,-400c’lik dipfrizde 3 defa dondurulup çözülerek, hücrelerin parçalanması sağlandı ve daha sonra 5000 devirde 10 dakika santrifüjlenerek elde edilen süper natant, antijen olarak kullanıldı. 

            Süpernatant, kaplama solüsyonu ile 1/16 oranında sulandırıldı ve ELİSA Striplerine kaplandı.

3.3.4. Konjugatlar
            Çalışmamızda keçi orijinli anti –human IgG ve IgM peroksidazlı konjugatlar kullanıldı. ( Anti IgG konj. Sigma a8775, 28F 8922) (Anti IgM konj. Sigma A-8650, 48F 8814). IgG ve IgM konjugatların 1/1000 sulandırımları kullanıldı (88,92)

3.3.5. Substrat
            Substrat olarak, Orto-fenilen diamin hidroklorür (OPD) den (Sigma P6912) yararlanıldı. Fosfat sitrat tamponu (25.7 ml 0.2 M dibazik sodtum fosfat + 24.3 ml 0.1 M sitrik asit + 50 ml deiyonize su pH 5) ile %0.04 OPD + %0.012 H2O2 konsantrasyonlarında taze olarak hazırlandı ve 10 dakika içinde kullanıldı (70). 

3.3.6. Testin Uygulanışı
            Test serumları ile kontrol serumları, vero hücre lizatı ile muamele edildi. Bu amaçla 0.25 ml serum üzerine 0.25 ml hücre lizatı ilave edildi. 1 saat 370 C’de bekletildi. Daha sonra % 1 sığır serum albumini ilave edilmiş % 0.05 Tweeen 20’li PBS ile 2.5 ml’ye tamamlanarak serumların 1/10’lük dilusyonları hazırlandı.(14,88,92). Daha önce hazırlanan Mumps virus antijeni ile kaplı 96 çukurlu mikro ELISA stripleriinn, ilk 4 çukuru PBS, negatif ve pozitif kontrol için, kalan diğer çukurlar ise test serumları için kullanıldı. Her çukura 1/10’lük serum dilusyonundan 0.1 ml ilave edildikten sonra, pleytler çalkalandı ve 370C’ de nemli ortamda 1 saat inkubasyona bırakıldı (41). I gG ve IgM antikorlarının saptanmasında aynı işlemler ayrı ayrı yapıldı. Striplerdeki serum dilusyonları aspire edildikten sonra yıkama solusyonu ile ve yarı otomatik yıkayıcı ile 3 defa 1’er dakika aralıklarla yıkandı. Peroksidaz ile işaretli anti-human IgG ve IgM konjugatlar,% 1 fötal dana serumlu PBS-Tween ile 1/1000 sulandırıldı. Her çukura 0.1 ml ilave edildikten sonra 370C’ de 1 saat bekletilerek aspirasyon işlemi yapıldı ve 3 defa yıkandı. Yıkama işlemini takiben taze hazırlanmış substrat (orto fenilen diamin dihidroklorür) solüsyonundan 1’er ml ilave edildi. 370C’ de 30 dakika bekletildi. Reaksiyon, her çukura 0.05 ml 1 NH2SO4 ilavesi ile durduruldu. Absorbanslar 490 nm de Biotek Instruments Mikropleyt Reader’da okundu.(88)

            Tüm serumlar yukarıda belirtildiği tarzda, kontrol antijenleri ile de test edildi.
 

         Sonuçların değerlendirilmesi:
            Negatif kontrol serum absorbanslarının ortalaması alınarak bulunan değere 0.15 eklendi ve cut-off değeri hesaplandı. Bulunan bu değerin %10 fazlasına kadar absorbans değerleri negatif, bunun üzerindeki değerler pozitif olarak değerlendirildi.

            ELISA IgM testinde romatoid faktörün de dikkate alınması gerektiği düşüncesinden hareketle, tüm serumlarda lateks testi (Behring. Rapi Tex RF 193820C) ile romatoid faktör araştırıldı (40).

3.3.7. Ticari ELISA Mumps Kiti:
            88 serumda Virotech Mumps ELISA kiti ile tarifine uygun olarak çalışıldı.

3.3.8. İstatistik
            Hemaglütinasyon Önlenim Testinin sonuçlarının duyarlılık, özgüllük ve negatif ,pozitif prediktivite, prediktivite etkiinliği literatürdeki formüllere göre hesaplandı (103).